河南大学团队揭示玉米抗旱新机制：ZmNAC16基因通过ABA信号调控气孔关闭
植物遗传转化 抗性
2026 年 5 月 15 日
抗旱遗传转化实验高频问答（上篇）：从材料选择到阳性验证
2026 年 5 月 22 日
本研究鉴定了一个在玉米细胞中高表达的NAC转录因子——ZmNAC16，并系统揭示了其通过直接激活ABA信号关键基因（ZmCIPK3、ZmNR1.2等）、促进ABA诱导的气孔关闭，从而增强玉米苗期抗旱性的分子机制。该研究为作物抗旱遗传改良提供了新的靶点基因，也为其他禾本科作物抗旱研究提供参考。
*文章链接：https://doi.org/10.1016/j.cj.2026.03.008
实验思路与方法
- 基因定位与特性分析：利用玉米表皮单细胞转录组筛选保卫细胞富集的ZmNAC16；分析蛋白结构、进化关系；烟草瞬时表达验证亚细胞定位；酵母实验检测转录活性。
- 遗传材料构建：通过基因编辑技术构建ZmNAC16敲除突变体（zmnac16-d1/d2）；通过遗传转化技术构建ZmNAC16过表达株系（OE-1/OE-2），以野生型B73-329为对照。
- 抗旱生理表型检测：测定叶温、气孔导度、离体叶片失水率；干旱处理后观察植株表型，检测组织含水量、MDA含量、幼苗存活率。
- 分子机制解析：RNA-seq筛选突变体差异表达基因；酵母单杂交（Y1H）、EMSA、双荧光素酶实验验证ZmNAC16与下游基因启动子的结合；ABA 处理验证基因与气孔的响应关系。
主要实验结果
1. ZmNAC16在气孔复合体中高表达，属于典型NAC转录因子
单核转录组数据表明，ZmNAC16在玉米表皮条的保卫细胞和副卫细胞中显著富集。蛋白序列分析显示其N端有保守NAC结构域，系统进化树说明其与多个NAC转录因子亲缘较近。启动子区含多种胁迫响应元件，提示其参与抗旱调控。
2. 过表达ZmNAC16提高抗旱性，突变体则相反
- 过表达系（OE）：
叶温升高、气孔导度降低、离体叶片失水减少
干旱5天后叶片仍挺立，组织含水量更高，MDA含量更低
复水后存活率达55%，而野生型仅24%
Fig. 2. The overexpression of ZmNAC16 promotes stomatal closure and drought resistance in transgenic maize seedlings.
- 基因编辑突变体（zmnac16-d1/d2）：
叶温降低、气孔导度增加、失水更快
干旱后叶片严重萎蔫卷曲，组织含水量下降，MDA升高，存活率显著低于野生型
Fig. 3. Gene editing mutation of ZmNAC16 diminished stomatal closure and drought resilience in maize seedlings.
3. ZmNAC16定位于细胞核，具有转录激活活性
酵母转录激活实验表明，全长及C端区域均能激活报告基因表达，说明其作为转录激活因子发挥作用。
4. RNA-seq揭示ZmNAC16调控多个抗旱相关基因
GO和KEGG富集分析显示这些基因涉及营养代谢、ABA信号等通路。
三个关键基因ZmCIPK3、ZmNR1.2和ZmPP2C81在突变体中表达显著降低，且干旱诱导其上调的能力受损。
5. ZmNAC16直接结合并激活靶基因ZmCIPK3和ZmNR1.2的启动子
证实ZmNAC16可与这些基序结合。
EMSA体外实验进一步证实ZmNAC16直接结合ZmCIPK3和ZmNR1.2启动子。
双荧光素酶报告实验表明，ZmNAC16能显著增强由上述启动子驱动的LUC报告基因表达。
6. ZmNAC16正调控ABA诱导的气孔关闭
ABA处理2小时后，过表达系的气孔开度最小，突变体的气孔开度最大，野生型介于中间。
说明ZmNAC16增强了保卫细胞对ABA的敏感性，促进气孔关闭。
Fig. 7. ZmNAC16 regulates ABA-induced stomatal closure in maize.
关于植物遗传转化
1）功能获得验证：通过农杆菌介导的玉米遗传转化，构建了ZmNAC16过表达株系（OE-1, OE-2），直接证明了该基因过量表达足以增强抗旱性。
2）功能缺失验证：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，创制了zmnac16-d1和zmnac16-d2两个独立突变系，从反面证实了ZmNAC16缺失会导致抗旱能力下降。
3）启动子-靶基因调控验证：在烟草叶片中瞬时共转化，依赖遗传转化技术快速验证转录因子对靶启动子的激活作用。
4）亚细胞定位与蛋白表达：借助烟草瞬时表达系统和大肠杆菌表达系统，分别完成GFP融合蛋白定位和His标签蛋白纯化。
聚焦抗旱转化，助力作物高产提质
