JIPB | 潍坊现代农业山东省实验室/北京大学现代农业研究院团队构建小麦高效基因编辑体系

Efficient gene disruption in polyploid genome by Cas9-Trex2 fusion protein

六倍体小麦是世界上最重要的粮食作物之一，其复杂的基因组一直是基因编辑领域的一大挑战。CRISPR/Cas9技术在动植物基因编辑中取得了革命性进展，但在小麦这一多倍体作物中的效率却不尽人意，尤其是在进行多基因编辑时更是如此。目前，通过优化启动子以提高sgRNA和Cas蛋白的表达量，或是通过工程化改造Cas蛋白，已成为提升编辑效率的两大策略。然而，鲜有研究聚焦于如何通过增强Cas9蛋白的核酸酶活性来进一步提高编辑效率。

JIPB近日在线发表了潍坊现代农业山东省实验室/北京大学现代农业研究院/小麦育种全国重点实验室李健/张华伟研究团队题为“Efficient gene disruption in polyploid genome by Cas9-Trex2 fusion protein”的论文，(https://doi.org/10.1111/jipb.13797)，通过将核酸外切酶Trex2融合到Cas9蛋白上，显著提高了六倍体小麦的基因编辑效率。

研究人员关注到基因编辑产生的平末端双链断裂 (DSBs) 在体内容易被直接连接恢复成野生型序列，降低编辑效率。已有研究报道共表达Cas9蛋白和核酸外切酶，如Trex2和I-SceI，可以显著提高基因编辑效率。在这项研究中，研究人员设计了三种基因编辑载体，比较Cas9、通过自剪切肽段共表达的Trex2-P2A-Cas9和Cas9-Trex2融合蛋白在六倍体小麦中的编辑效率，发现共表达Cas9和Trex2可以提高编辑效率，而Cas9-Trex2融合蛋白在单基因和多基因编辑中均取得了最高的编辑效率。在转基因T0代小麦中，含有Cas9-Trex2融合蛋白的pCas9T载体在六倍体小麦中实现了高达44.3%-94.7%的单基因敲除效率，并且获得了高达12.9%-26.3%的三基因纯合/双等位突变率。此外，pCas9T系统具有低基因型依赖性，在不同的小麦品种中 (春小麦Fielder和冬小麦SN48) 中都能保持高效的基因编辑能力。pCas9T主要导致5-25 bp的缺失，而pCas9主要产生单碱基插入和1-3 bp的缺失。值得一提的是，pCas9T系统展现出超强的一代多基因编辑潜力。作者通过构建一个包含三个sgRNA表达盒的载体同时编辑了九个基因位点，在25株T0代转基因小麦中，76%的植株在所有九个目标位点上发生了突变，36%的植株在九个目标位点上均为纯合/双等位基因突变。

图1 利用Cas9-Trex2融合蛋白构建高效小麦基因编辑体系

综上所述，pCas9T系统不仅在六倍体小麦中显著提高了编辑效率，还降低了基因型依赖性，为多倍体作物的基因编辑提供了新的解决方案，具有广泛的应用前景。

北京大学现代农业研究院潘文波博士（现华南师范大学青年英才）、科研助理高春蕾和牛德副研究员为该论文的第一作者，北京大学现代农业研究院李健研究员和张华伟研究员为通讯作者。中国科学院遗传与发育生物学研究所谢旗研究员、北京大学现代农业研究院邓兴旺院士和何跃辉研究员为该研究提供了指导和帮助。该项目得到了山东省自然科学基金项目 (ZR2021ZD30, ZR2022ZD22)、山东省重点研发计划项目 (ZR202211070163) 、山东省泰山学者青年项目（TSQN202103160）和山东省杰出青年科学基金项目(ZR202103010168) 的资助。

参考文献：

Pan, W., Gao, C., Niu, D., Cheng, J., Zhang, J., Yan, X., Long, Q., Zhu, Y., Sun, W., Xie, Q., He, Y., Deng, X.W., Zhang, H. and Li, J. (2024). Efficient gene disruption in polyploid genome by Cas9–Trex2 fusion protein. J. Integr. Plant Biol. https://doi.org/10.1111/jipb.13797

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