农杆菌介导的大豆遗传转化体系研究进展

摘要‍‍‍‍‍

近年来，由于基因工程的快速进展，转基因技术已成为了辅助大豆高分子养殖的最主要技术手段。有效的遗传转移系统是提升转基因育种效果的前提，而农杆菌所介导的遗传转移则是在植物遗传转移试验中常见的方式。经研究影响大豆转化效率因素有大豆基因型、草胺膦浓度、农杆菌菌液浓度、培养基中各激素之间的比例等。本文将对这些因素在大豆遗传转化体系中的影响进展情况加以介绍。

研究背景

大豆是世界上最主要的油料作物之一，同时也是主要的食品和饲料中的蛋白质原料。大豆种子中，不但富含一定量的人体必需氨基酸，还具有丰富的膳食矿物质、维生素、不饱和脂肪酸和异黄酮等对人类身体发育有利的物质。世界上栽培规模最大的转基因作物就是转基因大豆，在当时也是第一批进入商业栽培市场的转基因作物之一。科学研究已经证明，有着巨大使用价值的转基因作物新品种必须在成百上千乃至几万次的转化事件中选出[1]。

虽然大豆基因组序列已经被公布[2]，但大多数大豆基因的功能尚不清楚。所以，一个最有效、稳定的遗传转化方式就是研究大豆基因功能、通过分子育种培育大豆新品种的重要前提。大约 85%的转基因植物都是利用农杆菌介导的转化途径而成功得到的。农杆菌是一类革兰氏阴性菌，包含了根癌农球菌和发根农杆菌，两者各自包含了功能构造相同的Ti 质粒和 Ri 质粒，其上有一段 T-DNA。当植被受伤时，农杆菌可以通过侵染植被伤口进入细胞，通过将其 T-DNA 嵌入在植株基因组中，使得其所携带的基因可以直接在植株上表现。而受损植株根系中可以产生羟乙酰丁香酸和乙酰丁香酸，作为标志物质可以引导 Ti 质粒的 VIR 基因和根瘤菌染色体操纵子的表现。Vir 基因产物可以使 Ti 质粒上的 t-DNA 序列融合在宿主细菌的基因组上，从而能够通过减数分裂安全的遗传到下一代。农杆菌介导的转化方法有很多优点，如操作简单、重现性高、实验成本低等，因此是植物转化的最佳选择之一。然而，农杆菌介导法仍然存在诸多问题：其转化效率低、受多种因素影响等，这些问题限制了遗传转化效率。

本文总结了影响大豆遗传转化的各种因素， 为大豆遗传转化体系的调整及有关科学研究提供依据。

1、农杆菌侵染液浓度对大豆遗传转化的影响

农杆菌侵染液的浓度也是影响农杆菌转化效果的最主要因素之一，因此探究其在大豆遗传转化中的影响十分关键。如果农杆菌侵染液含量过低，就会有很少的农杆菌细胞和外植体接触，而无法进行有效的转化；当农杆菌侵染液含量过高，农杆菌细胞内部就会产生相互拮抗使其无法生长转化。皮照兴[3]等设置了 5 组不同浓度的农杆菌侵染液，OD600 依次是 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0。其中，当农杆菌侵染液浓度 OD600在0.6~0.8，抗性芽再生率最高且差异不大。孙昕[4]等利用不同浓度农杆菌菌液 (选择 OD600 分别为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9) 对“吉育47” 大豆进行侵染，进行共培养时长为 5d，5d 后再进行 GUS 染色，研究发现，当农杆菌侵染液 OD600 为0.7、0.8、0.9 时，子叶节区分生组织的 GUS 加染色点数量较多；再进一步研究 GUS 荧光值的数据，分析表明，当 OD600 为 0.8 时 GUS 表达量最大，其次是 0.7和0.9，所以选择农杆菌菌液OD600为0.7~0.8 范围内侵染 “吉育 47” 大豆其转化效率最好，这也为本文选择农杆菌侵染液浓度提供了参考。丛亚辉[5]等研究发现，OD650值分别为0.6、0.8和1.0等3个菌液浓度侵染大豆品种 “杰克紫” 子叶节时，GUS 瞬时表达率依次是 97.0%、90.7%和 85.6%，其中， OD650 为 0.6 时对大豆子叶节的侵染能力显著优于0.8 和 1.0，而 “天隆一号” 的试验结果也与 “杰克紫” 相同。所以农杆菌侵染浓度水平 OD650 为 0.6 时比较适用于大豆子叶节培养。李姝璇[6]等通过研究影响农杆菌侵染效率的主要因素并以大豆子叶外植体中 GUS 的瞬时表达率来评价农杆菌的侵染效率。结果发现，当农杆菌侵染液浓度 OD650 为 0.6 时，为侵染大豆子叶节的最适浓度，侵染效率可达到 96%以上。在 8 个大豆品种中，“天龙 1 号”、“杰克紫” 等大豆品种的农杆菌感染效率相对较高。在大豆子叶节转化中农杆菌的侵染浓度影响较大，近年来在大豆遗传转化实验中一般选择 OD600 为 0.6 ~ 1.0 为最佳侵染浓度。

2、大豆基因型对大豆遗传转化的影响

农杆菌介导的转化系统是目前大豆遗传转化中最常用的方法。筛选有利于农杆菌感染和组织再生的大豆基因型是建立高效遗传转化体系的重要步骤。由于进口转基因大豆质量高、价格低，中国大豆产量在过去10a中大幅下降。 目前，“威廉姆斯82” 和 “杰克” 大豆品种是国际上常用的大豆转化育种和研究品种。然而，这 2 个基因型的农艺性状较差，只适合在狭窄的地区种植[7]。因此，为了加快我国转基因大豆育种的进程，研究人员分别选择不同基因型大豆进行探究。2016 年，刘晨光[8]等选取了 “豫豆 22”、“冀 豆 16”、“中黄 42” 3 个大豆品种来探究不同基因型对子叶节再生效率，结果发现在同样的条件下，“豫豆22”芽诱导率和再生率较高，分别是41%和 15.3%；“冀豆 16” 次之，“中黄 42” 最差。由此可知 “豫豆 22” 适用于大豆遗传转化中。同年杨静小组[9]选择了 2 种国外大豆，9 种国内大豆进行研究，在转化过程中筛选出 “杰克”、“华春 6 号”、“沈农 9 号” 具有较高的再生率，其中 “沈农 9 号” 再生率和转化率均为相对较高水平，因此适用于大豆遗传转化中从而获得更多植株进行研究。2021 年，Mi-Suk Seo 等[10]报告了 21 个属于韩国大豆核心种质的大豆品种和 2 个国外品种 ( “杰克” 和 “Maverick” ) 的组织培养效率。在 21 个品种中，“关安”、“安平” 和 “色南” 有着密切的亲缘关系，这 3 个品种的发芽率和再生率都很高。此外，在参考基因组测序中使用的 “威廉 82” 和 2 个外国品种中也观察到了较高的组织培养能力。不同品种的大豆对农杆菌的易感程度呈现出显著的差异，不同基因型的大豆与农杆菌间的相互作用不同，因此在大豆遗传转化中选择再生率较高的大豆品种十分必要。

3、筛选剂种类及浓度对大豆遗传转化的影响

3.1  筛选剂种类

在大豆基因改造领域，筛选标记物是筛选利用转基因材料生长和转化细胞， 生存、增殖与成熟的重要因子。各种种类的筛选剂不但影响了转化效果，同时也限制了转基因材料的实用价值。目前有许多筛选剂，包括了抗生素类如潮霉素、卡那霉素，以及除草剂类如草甘膦、草胺膦等。

在多种植株的基因转化中，卡那霉素也常被用来作为抗性检测标记的主要抗生素之一。卡那霉素也是氨基胰腺外分泌细菌的主要抗生素，其中毒原理为与植株细胞器叶绿体和线粒体内的核糖体 30S 亚基紧密结合，进而抑制由转录进程所引起的细胞凋亡；而转化细菌则具有了对抗生素的耐受性，从而在某一确定浓度的高选择性抗生素的选择培养基中生存了下来；而未转换的细菌则因为没有该抗性基因， 而被抑制或杀灭[11]。

第一批转基因大豆是 Hinchee 等在 1988 年使用 nptII 基因生产的，该基因将卡那霉素作为一种筛选剂。大豆品种对卡那霉素的反应在愈合率方面比较相似，但在褐变率方面不同。王萍[12]等研究发现，不同大豆外植体对卡那霉素的反应存在显著差异，以真叶片的反应最敏感，下胚轴的反应最慢。虽然卡那霉素成本低、适用范围广，但不同基因型大豆的耐受性差异较大。

潮霉素抗性基因 hpt 是目前应用较多的标记基因之一，已经在许多植物的基因功能研究中获得了应用。潮霉素还能阻碍植株细胞叶绿体、线粒体内的核糖体和增长作用因子 EF-2 的融合，进而抑制多肽链的正常生长。当潮霉素在未转化细胞内时，就可与细胞中的 30S 核糖体融合，因而使细胞内蛋白质的合成困难，进而造成蛋白质的逐渐褐化死亡[13]，作用机理与卡那霉素相似。

草甘膦和草胺膦都是一种有机磷类的除草剂，具有生物活性高、效率高、毒性较小、杀草谱高、易于降解、少残留，以及对环境相对比较安全等优点。其可以杀灭几乎全部的绿色植物，而且对动物无害，所以是一种既安全又有效的除草剂，是农作物中使用较为普遍的一种除草剂[14]。宋张悦[15]等以草丁膦作为筛选试剂得到了 “天隆一号” 等 6 个较适宜的大豆受体品种，且平均转化效率都稳定在 2.4%以上。

3.2  筛选剂浓度

选择合适的筛选剂浓度也是大豆遗传转化效率的影响因素，因为筛选过程过严或过松均会降低对转化植株的筛选效率。

刘京等[16]研究了不同质量浓度的潮霉素对发状根生长诱导和根系伸长的影响。结果显示，潮霉素可有效抑制非转化细胞的生长发育，并可用作大豆发状根转化体系中的筛选试剂。同卡那霉素一样，不同种类的大豆对潮霉素耐受性有所差异。所得结果表明，“自贡冬豆”、“吉林小粒1号”、“吉育47” 和 “中黄 30” 在发状根诱导阶段的潮霉素适宜的筛选浓度依次是 40mg·L-1、16mg·L-1、16mg·L-1、 24mg·L-1；根伸长阶段则依次为49mg·L-1、46mg·L-1、33mg·L-1、55mg·L-1 。宋张悦[15] 等又成功构建了由一种农杆菌介导的以草甘膦作为的大豆遗传转化体系的直接筛选试剂，转化效率 0. 41%~3. 06%。研究人员经浓度梯度实验结果显示，当草甘膦的筛选浓度为 100mg·L-1 时，再生率降低了 2~3 倍，但是转化效率并不受限制。可见在高浓度筛选过程中，抗性外植体显示出了明显的生长优势，而且高浓度筛选还可以省去不少工作量，对降低假阳性率和增加转基因植株的抗性等方面，都会有一些效果。

张忻爽等[17] 用 “合丰 35”、“黑农 44” 和 “吉林 35” 的胚尖当外植体，研究了不同浓度的卡那霉素和草铵膦对各种基因型大豆胚尖不定芽所诱导的作用效果。结果表明，“合丰35”、“黑农44” 和 “吉林35” 的适宜卡那霉素的筛选浓度是100mg·L-1，而草胺膦浓度则依次是0. 6mg·L-1 、0. 2mg·L-1 和 0. 2mg·L-1。实验结果说明，不同基因型大豆再生体系中对不同品种及浓度的筛选剂有所不同，因此，在今后针对某一基因型进行遗传转化实验时，选用合适的筛选剂及其浓度是十分必要的，同时还应从对外植体不定芽的诱导率、芽数和芽长度等多种因子综合考察后进行判断。

在大豆遗传转化实验中，如果筛选剂浓度太低，则无法抑制或杀死未转化细胞，从而导致假阳性植株数量过多，进而干扰转化植株的筛选和鉴定等工作；若筛选浓度太高，则会杀死已经转化细胞或抑制其增殖发育，从而难以获得已转化植株。所以，人们开展了受体材料筛选剂耐受性实验，以研究设定合理的筛选临界浓度，确保理想的筛选效果十分关键[18] 。

展望

多年来，国内外的科研人员开发和优化了大豆遗传转化体系，进一步证实并丰富了大豆的基因功能，并获得了具有更多优良性状的新品种。由于中国农作物主要功能基因组学的研究开发，以及国际转基因大豆新品种培育研究工作的开展，安全高效的转基因技术的发展始终是中国转基因大豆研发的重点课题之一。多年的研究已经证实，大豆不定芽再生系统是大豆的遗传转化的主要途径。由于大豆对光周期的敏感，品种推广应用的适应范围有限，今后应优化大豆的加工方法和再生体系。 所以，未来大豆基因改造技术将选择产业上主栽品种为重点基因型，对其改造技术与再生系统加以完善；政府为满足对转基因大豆育种与功能基因研发的需求，也支持对其细胞再生系统的完善与改良。

参考文献

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