快速高效植物遗传转化方法案例：甘薯植物遗传转化系统

2024年1月，中国科学院华南植物园农业生物技术研究中心在《Plant Communications》在线发表了题为“A simple and efficient in planta transformation method based on the active regeneration capacity of plants”的研究论文。该论文报道了一种无需经过组织培养的遗传转化方法。

研究背景

‍基因改造的准确性主要依赖于植物的转化，这在大多数植物物种很难实现。目前，基于传统转化方式的基因编辑仅在少数具有代表性作物中成功实现。虽然在植物遗传转化技术的最新研究中取得了一些进展，但为了克服植物多样性带来的技术限制和挑战，仍然需要一种易于普遍应用于各种植物的新型转化策略。

研究结果

1、建立了一种简单而有效的甘薯植物遗传转化系统

由于植物的自然再生能力，植物可以从切除的器官开始繁殖，故此，可以通过植株再生而不是组织培养获得独立的转化体。作者选择了具有很强的无性繁殖能力的甘薯进行无组织培养转化方法的开发。

作者采用了浸泡、真空浸润、注射等多种初始方法，将带有GUS报告基因的根癌农杆菌转移至植物的叶、茎、花和根等组织中。同时也考虑了不同培养基对转化效果的影响。最后得到一种最优的转移方法：茎秆注射，并移栽至土壤基质。具体的操作要点在于：切除带有几个结节（即有侧枝、侧芽）的健康甘薯茎，每个结节处向上注射直至注射液从其他针孔或切口端渗出（图1）。不定根在移植后1周内自发发芽，并通过GUS报告基因快速检测出阳性突变体(图1B)。

茎插条的持续培养使得不定根中产生转基因新生叶、侧芽和块茎，并且在这些组织中也检测到阳性信号。通过随后的短期内正侧芽的无性繁殖或从正块茎中萌发的芽获得独立的转基因植株(图1C)。此外，作者还通过TAILPCR检测了转基因植物基因组中T-DNA插入的位置，并确定这些植物代表稳定且独立的转化系。阳性转化体的新生侧枝和块茎芽显示没有残留的农杆菌污染。这些发现初步证实，利用甘薯植株的主动再生能力，建立了一种有效的植物内转化方法。

图1 甘薯高效的遗传转化体系的建立

2、植物转化系统的优化

进一步地，为了提高转化效率，作者分别从转化菌种、菌株浓度以及是否添加化学添加剂SilwetL77和乙酰丁香酮这三个条件进行转化率的测定；最后选出最适宜甘薯利用的转化系统。本研究描述了一种不需要无菌工作条件的新型植物转化方法的发展，作者将这种方法命名为RAPID方法。在甘薯中进行优化后，该方法的转化率接近40%（表1），持续时间缩短至仅1个月。该方法明显优于红薯的传统组织培养方法（图2）。

图2 转基因传递系统的优化

3、RAPID方法可以传递多个报告载体

接下来，作者检测了几个报告基因在RAPID系统上的应用。为了避免甘薯自身荧光的干扰，作者选择了mScarlet荧光蛋白（激发波长为569 nm，发射波长为593 nm）作为转化的报告蛋白。正如预期的那样，通过PCR鉴定的大多数阳性新生组织表现出了明显的红色荧光。此外，从转化体再生的转基因植株的叶片中保持了较强的荧光信号(图3A)，这表明mScarlet是研究甘薯转化的合适荧光报告基因。然后利用RUBY可以在活的植物中产生可见的红色色素的特性，构建了RUBY报告系统，与其他报道类似，阳性甘薯植株表现出明显的红色表型(图3B)。

最后为了确定RAPID系统是否与基因编辑工具兼容，作者使用CRISPR-Cas9敲除甘薯的植物烯去饱和酶（PDS）同源物（g31261)。PDS功能的丧失会在多种植物中产生明显的白化表型。试验结果表明，转基因新生芽逐渐发育出明显的白化表型，成功完成了基因编辑（图3C）。

综上所述，这些结果表明RAPID是一种可靠的方法，可用于多种报告载体的递送，并可与基因编辑系统一起使用。

图3 RAPID 中报告载体和基因编辑工具的适用性

4、RAPID通过诱导分生组织细胞成功转化而产生阳性新生组织

已知侧芽和不定根是从韧皮部组织的分生组织细胞发育而来的，因此作者推测RAPID方法可能会诱导有再生能力的组织转化。为了验证这一假设，作者使用mScarlet作为报告基因来分析转化后的茎段。对照组未经处理的植株在茎的表皮层表现出自发荧光。转化体在茎的内部横截面上显示出清晰的荧光信号(图4A)，进一步观察发现这些信号主要定位于韧皮部的分生组织区域，包括形成层和内胚层(图4B)。这些结构的分布与甘薯侧芽和不定根的分化有关。同样，再生的转基因后代的侧芽和不定根表现出强烈的阳性信号。这些观察结果表明，RAPID方法可以通过植物的韧皮部诱导分生组织区转化，并且可以从侧芽和块茎芽中产生稳定的再生植株(图4C)。从注射到产生侧芽和块茎芽的时间分别为3 ~ 4周和6 ~ 8周。从块茎芽中获得的所有阳性细胞系都是非嵌合的，这支持了转基因起源于一个或几个分生组织细胞的观点。以上表明，RAPID方法可以产生稳定的转基因再生植株。

图4 通过RAPID系统将农杆菌直接输送到韧皮部

5、RAPID适用于不同的植物种类

为了评估RAPID方法在不同遗传背景下的适用性，作者首先对不同甘薯品种进行了测试，即采用人工光源法检测GFP信号。在GFP转化体的去皮茎、根和解剖块茎中观察到强烈的绿色荧光，表明RAPID方法可用于转化不同遗传背景的甘薯植物。总体而言，快速法对红薯的转化率较高(12.5% ~ 37.5%;图5 A)。同样地，作者分别对厚藤和马铃薯进行了多种转化，得到和上面相似的结果（图5 B-C）。

图5 RAPID在其他植物品种中的应用

结论

从理论上讲，RAPID可以应用于所有通过无性繁殖发育成独立植物的植物物种。本研究开发了一种简单有效的农杆菌介导转化系统，克服了现有转化策略的技术限制，具有不需要组织培养、特殊诱导的优势，也减少了基因突变的可能性，且提高了转化效率，耗时短。

参考文献：
Mei G, Chen A, Wang Y, et al. A simple and efficient in planta transformation method based on the active regeneration capacity of plants. Plant Commun. 2024;5(4): 100822.

文章转自林木科学评论，侵删