【PBT】番茄SIERF.F4转录因子增强果实抗灰霉菌能力且不影响成熟品质

番茄是全球重要的果蔬作物，但灰霉菌引起的灰霉病严重威胁其产量和采后品质，可造成10–20%的田间损失和大量采后腐烂。乙烯响应因子（ERF）是植物特有的转录因子家族，在防御病原菌中发挥关键作用。最近，《Postharvest Biology and Technology》 发表的一项研究“SlERF.F4 negatively regulates tomato fruit susceptibility to Botrytis cinerea independently of ripening traits”，聚焦于番茄ERF家族成员SIERF.F4，探究其在果实抗灰霉菌中的功能及调控机制，为培育抗病优质番茄提供理论依据。

二、研究思路与方法

1. 基因表达分析：检测SIERF.F4在果实不同发育阶段及灰霉菌感染后的表达动态。
2. 遗传转化材料创制：利用CRISPR/Cas9、RNAi和过表达技术获得SIERF.F4敲除（F4-KO）、敲低（F4-RI）和过表达（F4-OE）番茄株系。
3. 抗病性鉴定：接种灰霉菌后观察病斑直径、发病率；测定活性氧（ROS）含量、抗氧化酶（SOD、POD）活性和膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量。
4. 转录组测序（RNA-seq）：比较野生型（WT）和F4-KO果实感染前后的基因表达变化，筛选差异表达基因（DEGs）并进行功能富集分析。
5. 靶基因鉴定：结合DAP-seq数据，筛选SIERF.F4直接结合的基因，并通过双荧光素酶报告实验验证其对病程相关基因启动子的调控。
6. 上游调控机制：通过茉莉酸甲酯（MeJA）处理、双荧光素酶报告实验和凝胶迁移实验（EMSA）验证转录因子MYC2对SIERF.F4的调控。
7. 果实品质评估：测定不同成熟期的果实颜色、硬度、可溶性固形物、类胡萝卜素含量及采后失水率。

三、主要研究结果

本研究首先通过系统发育分析发现，SIERF.F4属于ERF家族Group VIII，含有保守的AP2/ERF结构域和两个EAR基序。表达分析显示，SIERF.F4在绿熟期果实中高表达，且受灰霉菌感染显著诱导。利用转基因材料接种灰霉菌后，F4-KO和F4-RI果实病斑显著增大、发病率升高，而F4-OE果实病斑略小于野生型，表明SIERF.F4正调控番茄果实对灰霉菌的抗性。

图2. SlERF.F4正调控番茄果实对灰霉菌的抗性

进一步生理生化分析发现，F4-KO和F4-RI果实中超氧阴离子（O₂⁻）和MDA含量显著升高，SOD和POD活性则明显降低；F4-OE果实呈现相反趋势，说明SIERF.F4通过增强ROS清除能力减轻氧化损伤。转录组测序比较感染后的F4-KO与野生型果实，发现差异表达基因富集于“真菌响应”、“免疫反应”和“氧化应激”等通路，其中多个病程相关基因（如PR1a、PR2a、PR3a、PR-STH2）及氧化应激相关基因（如POX1、PDH、PDR、GST）在F4-KO中表达受损。

图3. SlERF.F4减轻番茄果实感染过程中的氧化损伤

野生型（WT）、SlERF.F4 RNA 干扰株系（F4-RI）和过表达株系（F4-OE）果实接种灰葡萄孢后的超氧阴离子（O₂⁻）含量 (a-c)、丙二醛（MDA）含量 (d-f)、超氧化物歧化酶（SOD）活性 (g-i) 和过氧化物酶（POD）活性 (j-l)（星号表示与同期野生型相比存在统计学显著差异，单因素方差分析，*p<0.05，p<0.01）

结合DAP-seq数据，发现SIERF.F4可直接结合PR1a、PR2a、PR-STH2等基因的启动子，双荧光素酶报告实验证实其对PR2a、PR-STH2和CHI1具有转录激活作用，而对PR1a表现为抑制。上游调控机制研究表明，SIERF.F4受茉莉酸信号通路核心转录因子MYC2直接结合并激活，且MeJA处理可显著诱导其表达。

值得注意的是，尽管SIERF.F4参与抗病调控，但F4-KO、F4-RI、F4-OE与野生型在果实成熟时间、颜色、硬度、可溶性固形物、类胡萝卜素含量及采后失水率等方面均无显著差异，说明其在不影响果实品质的前提下增强抗病性。

综上，SIERF.F4通过JA/MYC2信号被激活，进而调控PR基因表达和抗氧化酶活性，减轻氧化损伤，最终降低番茄果实对灰霉菌的敏感性。

图8. SlERF.F4介导的番茄果实抗灰霉菌机制模型

四、研究意义

本研究系统揭示了SIERF.F4在番茄果实抗灰霉菌中的功能与机制，证明其作为茉莉酸信号下游的关键转录因子，通过调控PR基因表达和抗氧化系统增强果实抗病性，同时不影响果实成熟与品质。这一发现为培育抗病、优质番茄新品种提供了重要的分子靶点和理论依据，也为其他作物抗病育种研究提供了新思路。

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