【PBJ】重磅发现！中华根瘤菌鞭毛蛋白“主动激活免疫”调控豆科结瘤

豆科植物与根瘤菌的共生固氮，是农业生产中减少氮肥依赖的“天然密码”。长期以来，科学界普遍认为根瘤菌要成功结瘤，必须逃避免植物免疫识别。但华中农业大学曹扬荣团队发表在《Plant Biotechnology Journal》的最新研究，打破了这一传统认知——根瘤菌竟主动激活植物免疫，以此精准调控结瘤过程！这一发现为大豆、苜蓿等豆科作物的高产育种开辟了全新路径。

研究思路与方法

本研究以中华根瘤菌-豆科植物互作体系为研究对象，结合生物信息学分析、分子生物学实验、微生物基因编辑、植物基因编辑（CRISPR/Cas9）、细胞生物学检测、转录组分析、结构生物学模拟等技术，层层解析中华根瘤菌鞭毛蛋白对豆科植物免疫和结瘤的调控机制：

• 生物信息学分析：对中华根瘤菌属鞭毛蛋白序列进行系统分析，鉴定出具有免疫激活潜力的flg22变体。
• 免疫反应实验：通过ROS爆发、MAPK磷酸化、免疫基因表达等实验，验证flg22变体的免疫激活能力。
• 遗传突变体构建：构建中华根瘤菌鞭毛素基因（fliC）突变体及回补株；利用CRISPR-Cas9技术创制大豆GmFLS2a/GmFLS2b单、双突变体及蒺藜苜蓿MtFLS2突变体。
• 表型与分子分析：比较突变体与野生型在结瘤数量、固氮活性、免疫基因表达等方面的差异。
• 结构模拟：利用AlphaFold3模拟flg22与FLS2受体的结合模式。

主要研究结果

1. 关键“信号分子”：flg22^Sin-II肽段

研究团队分析了5811个根瘤菌目基因组，鉴定出19160个鞭毛蛋白，发现中华根瘤菌中存在一种特殊肽段——flg22^Sin-II。它是鞭毛蛋白的衍生物，仅这一类群具备免疫激活功能，且在中华根瘤菌菌株中广泛分布，是根瘤菌与植物“沟通”的核心信号；而flg22^Sin-I和flg22^Sin-III则无此功能。

图1. 中华根瘤菌与慢生根瘤菌鞭毛蛋白flg22区域的系统发育与保守性分析

图2. flg22^Sin-II 触发大豆的活性氧（ROS）产生

2. flg22免疫识别并负调控结瘤

构建中华根瘤菌HH103（大豆共生菌）、苜蓿中华根瘤菌2011（蒺藜苜蓿共生菌）、中华根瘤菌NGR234（百脉根共生菌）的fliC敲除突变体，接种对应宿主后发现：

•  单敲除fliC不影响根瘤菌的运动能力，排除了运动性对结瘤的干扰；
• 突变体根瘤菌接种后，大豆、蒺藜苜蓿、百脉根的结瘤数显著高于野生型根瘤菌，回补fliC基因后结瘤数恢复至野生型水平；
• 证明含flg22Sin-II的鞭毛蛋白对豆科植物结瘤存在负调控作用。

图3. 鞭毛蛋白缺失突变体的结瘤表型

3. 激活免疫的“关键开关”：Tyr-7残基

flg22^Sin-II能被豆科植物精准识别，核心依赖其7位的酪氨酸（Tyr-7）。

实验证明：一旦将Tyr-7突变为亮氨酸，该肽段就彻底丧失激活免疫的能力。通过AlphaFold3结构模拟进一步发现，Tyr-7能直接与植物受体GmFLS2a结合，是启动免疫信号的“钥匙”。

4. 宿主介导：FLS2是免疫调控结瘤的“核心媒介”

研究通过CRISPR/Cas9构建大豆和蒺藜苜蓿的FLS2突变体，明确了“flg22^Sin-II→FLS2→免疫→结瘤”的调控链。

• 受体功能验证：大豆拥有两个FLS2同源基因（GmFLS2a和 GmFLS2b）。研究发现，它们都能在拟南芥中互补fls2突变体对flg22的响应。更重要的是，利用CRISPR-Cas9技术构建的大豆*GmFLS2a/GmFLS2b*双突变体，对flg22^Sin-II和病原菌flg22触发的ROS反应均大幅减弱。
• 共生表型关联：该双突变体在接种野生型中华根瘤菌后，结瘤数显著多于野生型大豆。同样，在蒺藜苜蓿中敲除其MtFLS2基因，也导致了结瘤数增加和固氮酶活性提高。这些结果确凿地证明，植物通过FLS2受体感知根瘤菌的flg22^Sin-II，进而激活免疫并抑制共生进程。

图4. 大豆 GmFLS2a 和 GmFLS2b 参与 flg22 诱导的免疫反应并调控结瘤

图5. 大豆和蒺藜苜蓿 FLS2 突变体对根瘤菌的结瘤表型

5. 分子调控模型

研究表明：中华根瘤菌侵染时，其鞭毛蛋白中的flg22^Sin-II肽段被豆科植物FLS2受体识别；FLS2激活下游免疫信号（ROS 爆发、MPK3/6磷酸化、免疫基因上调）；免疫信号抑制共生相关基因的表达，从而限制结瘤数、延迟结瘤时间。 这种“主动激活免疫”的策略，使根瘤菌与植物维持“互利不互损” 的共生稳态，是长期共进化的结果。

图6. (C) 根瘤菌鞭毛蛋白介导的免疫抑制豆科植物结瘤的调控模型